細(xì)胞融合的步驟：
1.制備飼養(yǎng)細(xì)胞層 一般選擇小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。
與免疫小鼠相同晶系的小鼠，常用BALB／C小鼠，6～10周齡
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拉頸處死，浸泡在75％乙醇內(nèi)，3～5min
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用無(wú)菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜
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用無(wú)菌注射器注入5～6ml預(yù)冷的培養(yǎng)液(嚴(yán)禁刺破腸管)
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反復(fù)沖洗，吸出沖洗液
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沖洗液放人10ml離心管，1 200r／min／分離5～6min
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用20％小牛血清或胎牛血清的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至lXl0‘／ml
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加入96孔板，100ul/孔
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放人37℃C02孵箱培養(yǎng)
2．制備免疫脾細(xì)胞
zui后一次加強(qiáng)免疫3d后小鼠拉頸處死
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無(wú)菌取脾臟，培養(yǎng)液洗1次
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脾臟研碎，過(guò)不銹鋼篩網(wǎng)
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離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2次
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計(jì)數(shù)
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取脾淋巴細(xì)胞懸液備用
3．制備骨髓瘤細(xì)胞
般選用小鼠腹
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取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期骨髓瘤細(xì)胞離心
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用無(wú)血清培養(yǎng)液洗2次
4.融合
(1)將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50m1離心管中用無(wú)血清不*培養(yǎng)液洗1次，離心，l 200r／min，8min；棄上清液，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇(PEG)濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng)。
(2)90s內(nèi)加入37℃預(yù)溫的1m1 45％PEG(分子量4 000)溶液，邊加邊輕搖。37℃水浴作用90s。
(3)加37℃預(yù)溫的不*培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入lml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。
(4)離心，800r／rain，6min。
(5)棄上清液，用含20％小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。
(6)將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孑L板內(nèi)，每孔加100tzl。一般1個(gè)免疫脾臟可接種4塊96孔板。
(7)將培養(yǎng)板置37℃、5％CO：培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
細(xì)胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是將兩種細(xì)胞混合后加入PEG使細(xì)胞彼此融合。然后用培養(yǎng)液稀釋PEG，消除PEG的作用。將融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，分置培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)。融合過(guò)程中有3個(gè)問題應(yīng)特別注意，①細(xì)胞比例，骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比值可從1：2到1：10不等，常用1：4的比例。應(yīng)保證兩種細(xì)胞在融合前都具有較高活性。②反應(yīng)時(shí)間，在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中，第1分鐘滴加4。5ml培養(yǎng)液；間隔2rain滴加5ml培養(yǎng)液，然后加培養(yǎng)液50ml。③培養(yǎng)液的成分，良好的培養(yǎng)液對(duì)融合細(xì)胞尤其重要，其中的小牛血清、各種離子和營(yíng)養(yǎng)成分均需嚴(yán)格配制。如融合效率降低，應(yīng)隨時(shí)核查培養(yǎng)基情況。
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